Protein yang mengandungi valosin mengawal degradasi-mediasi proteasome dalam sel glioma | kematian sel & penyakit

Protein yang mengandungi valosin mengawal degradasi-mediasi proteasome dalam sel glioma | kematian sel & penyakit

Anonim

Subjek

  • Rintangan terapeutik kanser
  • Kanser kanser
  • Radioterapi
  • Ubiquitylation

Abstrak

Kinase protein yang bergantung kepada DNA (DNA-PK) mempunyai peranan penting dalam membaiki kerosakan DNA dan mengawal sensitiviti sinaran sel glioblastoma. VCP (protein yang mengandung valosin), protein chaperone yang mengawal degradasi protein ubiquitin yang bergantung kepada ubiquitin, di fosforilasi oleh DNA-PK dan direkrut ke laman rehat DNA untuk mengawal pembaikan kerosakan DNA. Walau bagaimanapun, tidak jelas sama ada VCP terlibat dalam degradasi DNA-PKcs (subunit pemangkin DNA-PKK) atau sama ada ia mengawal radiosensitiviti glioblastoma. Data kami menunjukkan bahawa DNA-PKcs adalah ubiquitinated dan terikat kepada VCP. Pengetatan VCP mengakibatkan pengumpulan protein DNA-PKcs dalam sel glioblastoma, dan perencat proteinase MG132 menyesuaikan peningkatan ini. Seperti yang dijangkakan, kenaikan ini meningkatkan kecekapan pembaikan DNA di beberapa garisan sel glioblastoma; Sebaliknya, aktiviti yang dipertingkatkan ini mengurangkan sensitiviti sinaran dan memanjangkan pecahan hidup sel glioblastoma dalam vitro . Selain itu, knockdown VCP dalam sel glioblastoma mengurangkan masa hidup tikus xenografted dengan rawatan radiasi berbanding tikus glioblastoma xenograft dikawal. Di samping itu, protein VCP juga dikurangkan dalam 25% daripada GBM daripada pesakit (WHO, gred IV astrocytoma), dan tahap protein VCP dikaitkan dengan kelangsungan pesakit ( R2 = 0.5222, P <0.05). Penemuan ini menunjukkan bahawa VCP mengawal kemerosotan DNA-PKC dan meningkatkan sensitiviti sel GBM kepada radiasi.

Main

Protein yang mengandungi Valosin (VCP), adalah ahli kelas AAA ATPases dan dikaitkan dengan pelbagai aktiviti selular. 1, 2 VCP adalah protein yang berlimpah dalam sitosol dan nukleus, 3, 4 dan wujud secara fisiologi sebagai homohexamer. Kebanyakan, jika tidak semua, heksam membuat kompleks lebih lanjut dengan protein penyesuai lain, seperti p47 atau Ufd1-Npl4, 5, 6 dan mengawal konjugasi protein ubiquitin ke proteasome melalui interaksi protein-protein untuk mengelakkan pembentukan rantai multiubiquitin yang berlebihan saiz. 2 Selain itu, data terbaru menunjukkan bahawa VCP juga mengawal ubiquitination protein dengan mengaktifkan enzim deubiquitinating, Ataxin-3. 7 Diyakini bahawa VCP diarahkan ke proses selular yang relevan melalui pembetulan berbeza kepada protein penyesuai tertentu. Setiap protom VCP terdiri daripada empat wilayah: terminal N, dua ATPase (D1 dan D2) dan kawasan-terminal C. 1, 9 Rantau N-terminal mempunyai aktiviti mengikat untuk protein penyesuai serta protein ubiquitinated. 1 VCP telah dicadangkan untuk melaksanakan banyak fungsi sel fisiologi, seperti degradasi protein yang ditengah oleh sistem ubiquitin-proteasome. 5, 10, 11, 12, 13, 14

Menariknya, VCP juga telah dilaporkan direkrut ke tapak pecah DNA (DSB) DNA dengan berinteraksi dengan BRCA1, p53 dan RAD51, dan ia mungkin mengawal pembaikan kerosakan DNA. 4, 15, 16 Satu kajian baru-baru ini telah mendedahkan bahawa VCP adalah substrat baru protein DNA yang bergantung kepada DNA (DNA-PK) dan ahli keluarga PIKK yang lain. 17 Sebagai tindak balas kepada kerosakan DNA, VCP di fosforilasi di Ser 784 di dalam terminal COOHnya, rantau yang ditunjukkan untuk menargetkan VCP ke petak intrasel tertentu; VCP kemudiannya terkumpul di tapak DSB dengan ubiquitin ligase RNF8, ubiquitin penyesuai UFD1-NPL4 dan rantai ubiquitin Lys-48-linked (K48-Ub). 16 Fosforilasi VCP yang disebabkan kerosakan DNA dan pengambilannya ke tapak DSB mencadangkan peranan untuk pembaikan DNA dalam VCP.

DNA-PK adalah kinase protein serina / threonine DNA yang dipelihara dalam DNA yang dikekalkan dalam vertebrata. 18 DNA-PK terdiri daripada subunit pemangkin (DNA-PKcs) dan satu heterodimer Ku, 19 dan di mana-mana dinyatakan di hampir semua sel mamalia. Banyak kajian telah menunjukkan bahawa DNA-PK mempunyai peranan penting dalam pembaikan DSB, terutamanya di penghujung tanpa homolog (NHEJ). Selain itu, DNA-PK bukan sahaja mempunyai peranan penting dalam laluan pembaikan kerosakan DNA, tetapi juga terlibat dalam proses fisiologi atau patologi penting lain, seperti sensitiviti radiasi, tindak balas keradangan dan ekspresi gen metabolik. 21, 22, 23 Walau bagaimanapun, masih belum diketahui bagaimana kemerosotan protein DNA-PK dikawal dan sama ada VCP mempengaruhi sensitiviti radiasi.

Dalam kajian ini, kita menyiasat persatuan VCP dengan DNA-PKcs dan kesan peraturan VCP terhadap radiosensitiviti sel glioblastoma. Data kami membuktikan bahawa DNA-PKcs telah dikuasai dan terikat kepada VCP; Pengetatan VCP mengakibatkan pengumpulan protein DNA-PKcs dalam sel glioblastoma dan peningkatan aktiviti DNA-PK, yang akhirnya meningkatkan fraksion survival sel-sel GBM selepas IR dan memendekkan waktu hidup tikus xenografted orthotopic.

Keputusan

VCP dikaitkan dengan DNA-PK dan domain D1 VCP adalah penting untuk mengikat ini

Menurut analisis bioinformatik, protein DNA-PKcs mengandungi motif VCP-berinteraksi (VIM), yang dipelihara dalam mamalia seperti manusia, monyet, lembu dan serigala (Rajah 1a). Untuk menentukan sama ada VCP dikaitkan dengan DNA-PK, co-immunoprecipitation (co-IP) dilakukan menggunakan antibodi DNA-PKcs di beberapa garisan sel glioblastoma; sel M059J adalah DNA-PKcs-kekurangan, dan digunakan sebagai kawalan negatif. Kesan Barat berikut ko-IP menunjukkan bahawa VCP ditarik ke bawah dengan DNA-PKcs (Rajah 1b); Lebih-lebih lagi, selaras dengan kajian terdahulu, 24 sel yang lebih sensitif, lebih banyak VCP bersekutu dengan DNA-PK, menunjukkan bahawa VCP mungkin berkaitan dengan rintangan radiasi. Walau bagaimanapun, radiasi itu sendiri tidak menjejaskan pengikatan VCP dengan DNA-PKcs (data tidak menunjukkan).

VCP dikaitkan dengan DNA-PK. ( a ) VIM dan penjajaran urutan protein di kalangan manusia, monyet, lembu dan serigala. ( b ) VCP ditarik balik oleh IP DNA-PKcs dalam pelbagai saluran sel GBM (WL: lysates sel seluruh). Sel-sel M059J DNA-PKcs dianggap sebagai kawalan negatif. ( c ) Lukisan skematis protein VCP dipenggal. Semua truncates ditandakan dengan epitope Bendera (FL: penuh-panjang). ( d ) Plasmid yang menyatakan domain VCP yang berbeza telah dialihkan secara berasingan ke dalam sel-sel 293T (con: vektor kosong), dan bendera imunmembembakan semula dilakukan. Kedua-dua DNA-PKC dan bendera dikesan dalam lysates sel-sel (panel bawah, ditunjukkan sebagai WL) atau bendera IP (panel atas)

Imej saiz penuh

Untuk menentukan lagi domain VCP yang penting untuk mengikat ini, plasmid yang mengandungi domain VCP yang berbeza telah dialihkan secara berasingan ke dalam sel 293T. Termasuk vektor kosong, tujuh plasmid, seperti yang digariskan dalam lukisan skema dalam Rajah 1c, diberikan dengan murah hati oleh Dr. Ueffing. 25 Dua hari selepas pemindahan, seluruh lysates dari 293T sel tertakluk kepada analisa blot barat, dan 1 mg jumlah protein digunakan untuk IP terhadap antibodi bendera. Blot Barat mengikut IP menunjukkan bahawa domain penuh N, dan domain D1 terisolasi, tetapi bukan domain D2, boleh terus mengikat DNA-PK, dan hanya domain ND1 protein gabungan boleh mengikat dengan DNA-PK . Protein gabungan ND2 tidak mempunyai pengikatan yang mengesankan dengan DNA-PK, dan protein gabungan D1D2 juga melemahkan afiniti mengikat domain D1 ke DNA-PK. Observasi ini mencadangkan bahawa domain D2 mempunyai pengaruh negatif terhadap pengikatan DNA-PK dengan VCP, yang boleh ditengahi oleh pelbagai mekanisme, termasuk perubahan yang mengikat atau perubahan yang saling eksklusif.

Di samping itu, protein DNA-PKcs yang penuh dengan VCP-immunopencipitated kurang daripada yang diimunisasi oleh domain N yang terasing atau D1; Lebih-lebih lagi, jumlah protein DNA-PKC dalam sel-sel 293T yang ditransmisikan sepenuhnya VCP juga berkurang. Pemerhatian ini mencadangkan bahawa isyarat yang dikurangkan kemungkinan besar disebabkan oleh penurunan jumlah protein DNA-PKC, dan overexpression VCP mungkin menyebabkan degradasi DNA-PKcs. Blot barat untuk lysates sel-sel menunjukkan bahawa semua kepingan yang mengandungi domain VCP sama-sama terekspresikan (panel bawah Rajah 1d).

Degradasi DNA-PKcs adalah bergantung ubiquitin-proteasome dan dikawal oleh VCP

Untuk menentukan sama ada degradasi protein DNA-PK bergantung kepada proteasomes dan sama ada VCP mengawal kemerosotan DNA-PK, VCP telah dikalahkan oleh shRNA yang disederhanakan lentivirus (shRNA ini telah disahkan oleh kumpulan lain 26 ) dalam U251 sel atau sel U87. Blots Barat menunjukkan bahawa DNA-PKcs dikendalikan dalam sel-sel VCP-knockdown, manakala overcover VCP mengurangkan jumlah DNA-PKcs (Rajah 2a), yang menunjukkan bahawa VCP mengawal paras protein DNA-PKcs. Mengenai fungsi VCP, VCP mungkin menjejaskan degradasi DNA-PKC. Untuk mengecualikan kemungkinan VCP mengawal transkripsi DNA-PKcs, PCR kuantitatif (q-PCR) dilakukan untuk menilai tahap DNA-PKcs mRNA. Tahap DNA-Pkcs mRNA dikesan dalam sel VCP-knockdown, sel-sel kawalan dan sel-sel ibu bapa (Rajah 2b). Seperti yang dijangkakan, tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam tahap mRNA DNA-PKcs di kalangan VCP knockdown U87, kawalan U87 atau sel U87 ibu bapa, yang menunjukkan bahawa VCP mungkin mengawal DNA-PKCs degradasi dan bukannya mengubah modulasi transkripsinya.

VCP dikawal DNA-PKC degradasi dan penurunan ini bergantung ubiquitin-proteasome. ( a ) U251 atau U87 sel telah dijangkiti dengan lentiviruses VRP shRNA atau lentiviruses VCP. Imunoblot dilakukan terhadap lysates sel-sel (Par: induk U251 sel; Consi: RNA tidak spesifik; VCPsi: siRNA khusus VCP). ( b ) PCR masa nyata dilakukan dengan menggunakan primer-spesifik DNA-PKcs dalam sel U251 yang dijangkiti dengan lentiviruses yang berbeza (Par: induk U251 sel); Tahap mRNA DNA-PKcs adalah relatif kepada GAPDH. ( c ) Panel teratas: DNA-PKcs telah diimunisasi semula, dan kedua-dua DNA-PKcs dan ubiquitin dikesan pada membran yang sama (WL: lysates sel seluruh). Panel bawah: DNA-PKcs dikesan di dalam sel-sel ibu bapa U251 dirawat dengan MG132 (125 nM) untuk dos yang dinyatakan. ( d ) Ibu bapa U251 atau sel U251 yang dijangkiti dengan lentiviruses yang berbeza telah dirawat dengan proteaseous inhibitor MG132 (50 μ M), dan protein DNA-PKcs dikesan pada titik masa yang ditunjukkan. ( e ) Ibu atau sel-sel induk U251 yang dijangkiti dengan lentiviruses yang berbeza telah dirawat dengan klorin inhibitor lysosome pada kepekatan yang dinyatakan, dan protein DNA-PKcs dikesan 12 jam selepas rawatan

Imej saiz penuh

Kerana degradasi protein-mediated VCP adalah ubiquitin-proteasome-dependent, untuk menentukan sama ada DNA-PKcs adalah ubiquitinated, DNA-PKcs telah disucikan melalui IP dan diikuti dengan pengesanan ubiquitin. Blot barat menunjukkan bahawa isyarat ubiquitin hanya muncul di sel-sel U251 DNA-PKcs dengan saiz DNA-PKcs, tetapi tidak dalam sel M059J DNA-PKcs atau lorong IgG tidak spesifik, yang menunjukkan bahawa DNA-PKcs adalah ubiquitinated (Rajah 2c). Untuk mengenal pasti sama ada kemerosotan DNA-PKC bergantung kepada sistem proteasome, sel-sel U251 dirawat dengan penghambat proteinase MG132 (125 nM) dan dituai pada titik masa yang ditunjukkan (0, 12, 24, 48, 72 jam) berdasarkan separuh hayat protein DNA-PKcs.

Data blot barat menunjukkan bahawa tahap protein DNA-PKcs meningkat dengan ketara 24 jam selepas rawatan MG132; semakin lama rawatan itu berlanjutan, lebih banyak DNA-PKcs terkumpul (Rajah 2c), yang menunjukkan bahawa kemerosotan DNA-PKC bergantung kepada sistem ubiquitin-proteasome, walaupun band-band yang biasa dicampakkan tidak dapat dilihat, berat molekul DNA-PKcs (460 KD). Untuk menentukan sama ada pengetatan VCP mempunyai kesan sinergistik terhadap pengumpulan DNA-PKcs dengan pencerobohan proteasome, kawalan dan sel U251 VCP-knockdown dirawat dengan MG132 untuk masa yang ditunjukkan (0, 3, 6, 12 h). Immunoblots menunjukkan bahawa DNA-PKcs meningkat secara mendadak dalam sel U251 VCP-knockdown 3 jam selepas rawatan MG132 (Rajah 2d). Selain itu, untuk mengecualikan kemungkinan peningkatan ini bergantung kepada lisosom, sel-sel U251 yang diketepikan oleh VCP dirawat dengan klorokin inhibitor lysosome pada kepekatan yang ditunjukkan. Blot barat menunjukkan bahawa klorokin tidak mempunyai kesan ke atas pengumpulan DNA-PKcs, walaupun 6 jam selepas rawatan; Sebaliknya, klorokin menurunkan tahap protein DNA-PKcs dan VCP (Rajah 2e). Secara ringkasnya, data kami menunjukkan bahawa DNA-PKcs telah terkandung di mana dan VCP mengawal DNA-PKcs degradasi melalui sistem ubiquitin-proteasome.

Pengetatan VCP meningkatkan aktiviti DNA-PK dan meningkatkan kecekapan pembaikan kerosakan DNA

Untuk menentukan sama ada VCP mengawal selia aktiviti DNA-PK serta tahap protein DNA-PKcs, aktiviti DNA-PK endogenus langsung dinilai melalui in vitro kinase assay, dan secara tidak langsung diukur melalui fosforilasi endogen RPA32 (subunit 32-kDa replikasi protein A). Walaupun RPA32 secara fosforilasi berbeza dengan tiga PI3Ks (ataxia telangiectasia mutated protein, ATM, protein yang berkaitan dengan ATM-Rad3 dan DNA-PK) sebagai tindak balas kepada agen kerosakan DNA yang berlainan, DNA-PK adalah kinase utama yang bertanggungjawab terhadap camptothecin (CPT) Fosforilasi RPA32; 27, 28, 29, 24, fosforilasi RPA32 yang disebabkan oleh CPT merupakan penunjuk lain aktiviti DNA-PK.

Dalam in vitro kinase assay, data kami menunjukkan bahawa DNA-PK diaktifkan oleh sinaran mengion dan bahawa VCP knockdown meningkatkan pengaktifan ini, iaitu satu setengah kali lebih banyak daripada itu dalam sel-sel kawalan, seperti ditunjukkan dalam grafik pertama Rajah 3a . Sebagai tindak balas kepada rawatan CPT, phosphorylation Ser 4/8 RPA32 diperhatikan sebagai penampilan band mobiliti yang berkurang berbanding band ibu bapa RPA32, dan band beralih ini disahkan oleh antibodi khusus fosforilasi. Fosforilasi RPA32 yang diinduksi oleh CPT dalam sel U251 ibu bapa, sel U251 dengan knock down atau kawalan siRNA (Rajah 3a) dianalisis oleh densitometry menggunakan perisian ImageJ (NIH, Amerika Syarikat). Nisbah fosforilasi RPA32 (panel atas) kepada jumlah RPA32 (dua band dalam panel kedua), yang mewakili aktiviti DNA-PK, dikira dalam setiap lorong. Nisbah p-RPA32 di dalam sel-sel U251 VCP-knockdown adalah dua kali lebih banyak daripada yang di dalam kawalan U251, seperti ditunjukkan pada grafik terakhir Rajah 3a. Jumlah RPA32 telah meningkat dalam sel VCP-knockdown, tetapi punca ini tidak diketahui.

Pengetatan VCP meningkatkan aktiviti DNA-PK dan meningkatkan kecekapan pembaikan kerosakan DNA. ( a ) Ibu atau sel-sel Ibu bapa U87 yang dijangkiti dengan lentiviruses kawalan atau lentiviruses vCP shrna dirawat dengan radiasi 5 Gy atau camptothecin (20 μ M). In vitro kinase assay dilakukan pada sel yang dirawat dengan radiasi. Sel-sel yang dirawat dengan CPT tertakluk kepada imunoblot, dan ser 4/8 fosforilasi RPA32 dikesan oleh analisis densitometry 2 h selepas rawatan (lajur menunjukkan ± SD minima, tiga eksperimen bebas dilakukan). Nisbah fosfor-RPA32 kepada jumlah RPA32 dikira, dan nilai itu dinormalisasikan kepada ketumpatan β -actin. ( b ) Sel-sel U87 yang dijangkiti dengan lentiviruses kawalan atau lentiviruses VCP shRNA dirawat dengan radiasi 5 Gy; sel-sel dituai pada titik masa yang ditunjukkan untuk ujian komet, dan 100 sel dalam setiap kumpulan diukur untuk nilai OTM dan panjang ekor. ( c ) Sel-sel U87 dengan lentiviruses kawalan atau lentiviruses shRNA VCP telah diimunisasi dengan γ -H2AX selepas menerima 2 Gy radiation; 100 sel dikira, dan grafik membentangkan bilangan purata foci per sel pada titik masa yang ditunjukkan (merah: γ -H2AX; biru: DAPI). (Par: induk sel U87; Consi: RNA tidak spesifik; VCPsi: siRNA khusus VCP)

Imej saiz penuh

Selain itu, ujian COMET dan γ- H2AX, yang mewakili tahap kerosakan DNA dalam setiap sel, telah dilakukan untuk menilai kecekapan pembaikan kerosakan DNA. Dalam ujian COMET, sel-sel telah disinari dengan 10 radiasi Gy pada ais. Sel-sel yang dirawat dituai dan pulih untuk masa yang dinyatakan (30, 180, 360 min), dan sel-sel telah tertakluk kepada elektroforesis sel tunggal di bawah keadaan neutral. Setiap kali, 200 sel untuk setiap kumpulan diukur sebanyak 200 kali pembesaran. Panjang ekor diukur dan nilai ekor ekor ekor (OTM) dihitung dengan menggunakan perisian CASP berdasarkan formula: OTM = ekor DNA% × (maksud purata ekor kepala). Selepas 30 minit, tidak terdapat perbezaan yang signifikan antara sel-sel U251 kawalan dan sel VCP-knockdown. Walau bagaimanapun, selepas 3 atau 6 jam pemulihan, panjang ekor atau nilai OTM jelas lebih panjang atau lebih besar dalam mengendalikan sel U251 berbanding dengan sel-sel U251 VCP-knockdown ( P <0.05), seperti yang ditunjukkan dalam Rajah 3b, yang mencadangkan bahawa kejatuhan VCP mempromosikan kecekapan pembaikan DNA.

Selain itu, satu lagi penanda kerosakan DNA, γ -H2AX foci, juga dikira dalam sel U251 yang dirawat dengan radiasi 2 Gy (data dengan dos radiasi yang lain tidak ditunjukkan). Satu jam selepas radiasi, fasa γ- H2AX besar-besaran diperhatikan di kedua-dua sel kawalan U251 dan sel-sel VCP-knockdown, dan hampir setiap sel tunggal mengandungi banyak fokus (titik merah). Enam jam selepas radiasi, sel-sel kawalan yang paling tidak mempunyai perubahan mendadak dalam γ- H2AX pewarnaan, manakala fokus pada separuh daripada sel VCP-knockdown telah hilang ( P <0.01) (Rajah 3c). Akhirnya, kedua-dua sel kawalan dan VCP-knockdown tidak dapat dikesan selepas 24 jam pemulihan. Semua pemerhatian ini menunjukkan bahawa kejatuhan VCP meningkatkan aktiviti DNA-PK dan meningkatkan kecekapan pembaikan kerosakan DNA.

VCP knockdown meningkatkan pecahan hidup sel GBM selepas rawatan radiasi dan memperlahankan hidup tikus xenografted orthotopic

Untuk menentukan sama ada VCP mengawal sensitiviti radiasi sel GBM, in vitro clonogenic assay dan dalam model tetikus vivo orthotopic digunakan dalam kajian ini. Dalam ujian klonogenik, menandakan sel-sel U87 VCP-knockdown atau sel U251 telah dipilih dalam hidangan 100-mm (400 sel); sel-sel telah disinari pada dos yang dinyatakan dan kemudian dibiakkan selama 2 minggu. Tanah jajahan yang mengandungi 50 sel atau lebih dikira. Pengetatan VCP meningkatkan pecahan hidup di kedua-dua sel U251 dan sel U87. Selepas 2 Gy radiasi, VCP knockdown mempromosikan survival sel U251 dari 29.3 hingga 51.3% ( P <0.01) dan survival sel U87 dari 34.9 kepada 62.3% ( P <0.01) (Rajah 4a). Sel U87 lebih tahan terhadap radiasi daripada sel U251, yang konsisten dengan kajian terdahulu kami. 24 Tiada kesan yang ketara terhadap kelangsungan hidup antara kawalan dan U251 atau sel U87 ibu bapa. Untuk mengesahkan sama ada ketegangan VCP meningkatkan rintangan radiasi bergantung kepada DNA-PK, sepasang sel GBM-mahir (M059K) dan kekurangan- (M059J) GBM digunakan dalam kajian ini. Data kami menunjukkan bahawa pengetatan VCP meningkatkan ketahanan sel M059K DNA-PK yang mahir, tetapi bukan sel-sel M059J DNA-PK, yang menunjukkan bahawa rintangan radiasi yang dihasilkan oleh VCP adalah bergantung kepada DNA-PK.

VKP knockdown meningkatkan rintangan sinaran sel GBM. ( a ) Ibu bapa U251, U87, M059K, M059J atau sel-sel yang dijangkiti dengan lentiviruses kawalan atau lentiviruses vCP shRNA secara berasingan telah dibuang secara berasingan dalam hidangan 10 cm (400 sel setiap hidangan), ujian klonogenik dilakukan selepas rawatan radiasi pada dos yang dinyatakan, dan pecahan hidup telah dinormalisasi untuk mengawal sel. ( b ) lengkung kelangsungan hidup Kaplan-Meier dibuat untuk tikus GBM orthotopic dalam empat kumpulan (* P <0.05); peningkatan sinaran masa kelangsungan hidup dikira berdasarkan rumus: peningkatan radiasi masa kelangsingan hidup = masa kelangsungan hidup / masa kelangsungan hidup tanpa rawatan radiasi. ( c ) Saiz tumor purata dan imej MR wakil dalam setiap kumpulan dan imej imunofluoresensi VCP wakil (merah) dalam bahagian glioblastoma xenograft. ( d ) Analisis korelasi paras protein VCP dengan kelangsungan pesakit, dan imej imunohistokimia VCP wakil di bahagian parafin daripada pesakit glioblastoma. ( e ) Gambar wakil dari setiap kumpulan (Con: tisu para-tumor)

Imej saiz penuh

Dalam model tetikus orthotopic, sel U87 yang dijangkiti dengan virus kosong berfungsi sebagai kawalan, dan 48 tikus secara keseluruhan disuntik. Sembilan hari selepas suntikan, tumor yang mengandungi tikus (39 tikus) secara rawak dibahagikan kepada dua kumpulan mengikut pengimejan MRI, termasuk penyinaran IR dan bukan IR. Setiap kumpulan mengandungi subkumpulan kawalan dan ketukan (10 tikus dalam setiap kumpulan kecil). 6 Gy radiasi jumlah diberikan tiga kali lebih dari 1 minggu; jadual diterangkan dalam bahagian Bahan dan Kaedah. Masa hidup setiap tikus dicatatkan, dan semua masa bertahan dalam setiap kumpulan dianalisa menggunakan kaedah Kaplan-Meier. Data kami menunjukkan bahawa rawatan radiasi memanjangkan masa hidup tikus dalam semua kumpulan. Dengan rawatan radiasi, tikus dalam kumpulan VCP-knockdown terselamat untuk masa yang lebih pendek (38.4 hari, masa hidup median) daripada tikus dalam kumpulan kawalan, yang masa hidupnya adalah 53.8 hari (Rajah 4b). Tanpa rawatan radiasi, masa survival dalam kumpulan VCP-knockdown sedikit lebih pendek daripada kumpulan kawalan. Nisbah peningkatan radiasi masa kelangsungan hidup dalam kumpulan VCP-knockdown adalah 2.69%, jauh lebih rendah daripada itu dalam kumpulan kawalan (27.1%); perbezaannya adalah signifikan secara statistik ( P <0.001) (Rajah 4b).

Berdasarkan imej tumor tumor MRI pada hari ke-9 selepas suntikan intrakranial, saiz tumor dalam setiap kumpulan berbeza, tetapi tidak ketara, seperti yang dilihat dalam gambar-gambar perwakilan dalam graf tengah Rajah 4c. Seperti yang kita jangkakan, saiz tumor dalam kumpulan VCP-knockdown pada hari ke-29 adalah jelas lebih besar daripada itu pada tetikus yang sama pada hari ke-9, seperti ditunjukkan dalam imej wakil di lajur kanan grafik tengah (Rajah 4c). Jumlah tumor purata dalam setiap kumpulan dikira dan ditunjukkan dalam Rajah 4c. Saiz tumor menyusut lebih banyak (28.9%) dalam kumpulan kawalan daripada kumpulan VCP-knockdown (6.3%) selepas rawatan radiasi. Gambar perwakilan pendarfluor pendarfluor tahap protein VCP dalam GBM xenograf yang ditunjukkan dalam Rajah 4c.

Untuk melanjutkan penyiasatan VCP dan kesannya terhadap sensitiviti radiasi GBM, ungkapan protein VCP di bahagian GBM dari pesakit (kelas IV astrocytoma) telah dipisahkan dengan perisian analisa kuantitatif Tissue IA (Leica, Solms, Germany), dan korelasi dengan kelangsungan hidup masa telah dianalisis. Semua imej digital telah dinormalisasikan kepada kawalan negatif. Skor kurang daripada 10% dianggap '-'; skor yang melebihi 10% dan kurang daripada 25% dianggap sebagai '+'; dan skor lebih daripada 25% dianggap sebagai '++'. Data menunjukkan bahawa VCP secara berbeza dinyatakan dalam tisu GBM dan bahawa tahap ekspresi VCP secara positif berkorelasi dengan masa kelangsungan pesakit ( R2 = 0.5222, P <0.05). Pesakit yang mempunyai tahap VCP yang tinggi akan bertahan lebih lama dengan rawatan radiasi (Rajah 4d). Gambar wakil ditunjukkan dalam Rajah 4e. Pemerhatian ini konsisten dengan data haiwan kami.

Perbincangan

Kami mula-mula mendapati bahawa DNA-PKcs adalah ubiquitinated dan terikat kepada VCP; rawatan dengan inhibitor proteasome (MG132), tetapi bukan perencat lysosome (chloroquine), meningkatkan tahap protein DNA-PKcs; Pengetatan VCP mempunyai kesan sinergistik dengan rawatan MG132 terhadap pengumpulan protein DNA-PKcs. Sebagai pembawa, VCP mengikat protein polyubiquitinated dan menyampaikannya kepada sistem proteasome untuk degradasi; Oleh itu, sama ada perencatan proteasome atau knockdown VCP meningkatkan tahap protein DNA-PKcs, dan gabungan kedua-dua sinergistik meningkatkan tahap protein DNA-PKcs. Pemerhatian ini menunjukkan bahawa VCP mengawal DNA-Pkcs degradasi protein, yang bergantung kepada ubiquitin-proteasome. Menariknya, rawatan MG132 juga meningkatkan tahap protein VCP itu sendiri, yang menunjukkan bahawa kemerosotan VCP juga dikawal oleh sistem ubiquitin-proteasome. Selain itu, rawatan chloroquine secara tidak sengaja menurunkan tahap protein DNA-PKcs dan VCP dalam sel glioblastoma, yang menunjukkan bahawa perencatan lysosome dapat meningkatkan kemerosotan protease atau endoplasmic yang berkaitan dengan kerentanan yang berkaitan dengan komposisi.

Tambahan pula, walaupun DNA-PK dianggap sebagai protein nukleolus, pemerhatian kami menunjukkan bahawa DNA-PK, atau sekurang-kurangnya subunit pemangkinnya, juga terletak di sitoplasma, 21 dan VCP yang berkaitan dengannya dan mengawal degradasinya. Eksperimen bersama-IP mengenal pasti bahawa kedua-dua domain N-terminal dan domain D1 protein VCP boleh mengikat kepada DNA-PK, yang selaras dengan penemuan baru-baru ini eksperimen bersama IP dan biolayer interferometri menggunakan peptida VIM gp78; 30 kesimpulan ini juga sebahagiannya konsisten dengan data awal yang menunjukkan bahawa protein rhodopsin (P23H) hanya berinteraksi dengan domain p97ND1, tetapi bukan domain p97N terisolasi. 25 Walau bagaimanapun, domain VCP ND2 tidak memperlihatkan mengikat dengan DNA-PKcs, dan domain D1D2 juga melemahkan pertalian yang mengikat domain D1 dengan DNA-PKcs. Keputusan ini menunjukkan bahawa persatuan VCP dengan protein sasaran terjejas oleh perubahan konformasi, yang mungkin disebabkan oleh ATP mengikat / hidrolisis atau mengikat hierarki. Selain itu, dilaporkan bahawa satu penggantian asid amino tunggal (R155H) pada antara muka antara domain N-terminal dan domain AAA bersebelahan (D1) VCP mengakibatkan pertalian berkurang untuk ADP. Walaupun data sebelumnya menunjukkan bahawa VCP di fosforilasi oleh DNA-PK sebagai tindak balas terhadap kerosakan DNA, tidak jelas apakah phosphorylation ini VCP mempengaruhi pengikatannya dengan DNA-PK atau mengawal pengaktifan VCP.

Di samping itu, kajian biokimia dan struktur telah menunjukkan bahawa beberapa koefactor yang diiktiraf oleh VCP (p97) mengandungi domain regulasi ubiquitin X (UBX) yang terdapat dalam keluarga protein UBX atau domain seperti NPL4 seperti ubiquitin. 30 Selain fakta bahawa VCP di fosforilasi di Ser 784, DNA-PKcs juga mengandungi motif VIM 'AAXXR' (Rajah 1a), yang dipelihara dalam mamalia dan konsisten dengan penemuan terdahulu. Data kami juga menunjukkan bahawa DNA-PKcs adalah ubiquitinated dan degradasinya adalah ubiquitin-proteasome-dependent; Walau bagaimanapun, laman web DNA-PKcs dan E3 ligase berkaitan yang belum dijumpai belum dijumpai dan akan ditangani dalam kajian masa depan kita.

DSB adalah jenis kerosakan DNA yang paling mematikan; jika sel tidak dapat memperbaiki kerosakan ini, DSBs yang tidak dapat diperbaiki boleh mengakibatkan kematian sel. Sebagai komponen utama NHEJ, DNA-PK mengawal proses pembaikan DSB dan mengekalkan kestabilan genom. Perubahan pada aktiviti DNA-PK atau jumlah protein DNA-PKC kemungkinan besar akan mengubah sensitiviti sel ke tekanan genotoksik, seperti radiasi. Adalah diketahui bahawa DNA-PKcs - / - tikus adalah hipersensitif kepada radiasi dan menjalani apoptosis yang bergantung kepada ATM- dan p53. 32, 33, 34 Walau bagaimanapun, data dari TCGA dan kumpulan kami menunjukkan bahawa tidak terdapat perbezaan yang signifikan dalam paras protein DNA-PKcs antara tisu glial normal dan tisu tumor GBM, walaupun dalam sesetengah kes, analisis imunohistokimia menunjukkan bahawa sel-sel tumor mengekspresikan lebih banyak DNA -PKcs daripada tisu biasa yang berdekatan, 35 yang mungkin disebabkan oleh kekhususan tisu.

Untuk mengelakkan kesan sampingan yang berpotensi yang disebabkan oleh inhibitor DNA-PK, mensasarkan protein pengawalseliaan DNA-PK yang dikawal selia dalam sel-sel glioblastoma yang tahan radiasi adalah strategi alternatif untuk rawatan radiosensitisasi. Sebelum ini kami mendapati bahawa protein fosfatase PP6 mengawal sensitiviti radiasi sel GBM melalui DNA-PK, dan yang mengetuk PP6c meningkatkan masa hidup tikus; Lebih-lebih lagi, PP6c terlalu terkesan dalam 44.7% (17 daripada 38 kes) pesakit GBM. 21, 22, 36, 37, 24

Dalam kajian ini, mengetuk VCP bukan sahaja menyebabkan pengumpulan protein DNA-PKcs, tetapi juga meningkatkan aktiviti DNA-PK dan mempromosikan kecekapan pembaikan kerosakan DNA dalam sel GBM. Walaupun knock down VCP menjejaskan pengambilan 53BP1 ke dalam tapak kerosakan DNA dan seolah-olah meningkatkan sensitiviti radiasi dari sel U2OS dan nematod, 15, 16 data kami menunjukkan bahawa pengumpulan DNA-PK meningkatkan kecekapan pembaikan kerosakan DNA dalam sel GBM, yang mungkin menjadi hasil dari laluan bebas p53 dan peranan sel VCP yang berlainan dalam pelbagai jenis sel. 38 Dalam kajian vivo kami mengesahkan bahawa VCP knockdown mengurangkan radosensitiviti dan mempersingkat masa hidup tikus dalam model orthotopic GBM. Data klinikal juga menyokong kesimpulan ini. Oleh itu, molekul kecil yang secara selektif menyasarkan protein VCP dapat mempengaruhi sensitiviti sinaran dengan mengawal paras protein DNA-PK. Pengamatan ini menunjukkan bahawa protein pengawalan DNA-PK adalah sasaran yang berpotensi untuk rawatan radiosensitisasi.

Glosari

VCP

protein yang mengandungi valosin

DNA-PK

Kinase protein yang bergantung kepada DNA

ER

retikulum endoplasmic

ERAD

Degradasi protein yang berkaitan dengan ER

DSB

Pecahan dua helai DNA

VIM

Motif VCP-berinteraksi

NHEJ

tidak dapat menyertainya

ATR

Protein berkaitan dengan ATM-Rad3

ATM

ataxia telangiectasia protein bermutasi

CPT

camptothecin